HPLC (高效液相色谱法) 由于具有分析速度快、特异性强、准确度高、精密性好以及易于自动化等优点，使其成为检测、分离和定量领域最常用的分离技术。为了优化 HPLC 方法，我们需要研究多个色谱参数，包括：样品前处理、流动相选择、色谱柱选择和检测器选择。本文的目的是介绍方法开发、优化和验证流程。
建立分析方法的流程包括：色谱条件优化和了解分析物的理化性质。随后的步骤包括样品制备、方法改进和方法验证，以确保分析结果的准确和可靠。
了解分析物的理化性质
在为分析物制定分析方法时，了解其理化性质至关重要。首先考虑的因素包括分析物的 pH 值、极性、溶解度和 pKa。极性是一个关键的物理性质，它指导着溶剂和流动相组分的选择。分析物的溶解度与极性相关，遵循“相似相溶”的原则。流动相或稀释剂的选择则受分析物溶解度的影响，以确保兼容性。分析物不能与 HPLC 系统成分发生反应，且能溶解。Ph 和 pKa 等参数在 HPLC 方法开发中至关重要，影响着溶剂的选择和整个方法的成功与否。
在 HPLC中，针对可电离的分析物，优化 pH 值往往能获得尖锐、对称的色谱峰。在定量分析中，要获得低检测限、低进样偏差和稳定保留时间，确保精确测量和可靠结果所需的精度和灵敏度，尖锐且对称的色谱峰至关重要。
优化色谱条件
在方法开发初始阶段，需要确定一套条件，包括检测器、色谱柱和流动相，并生成样品的“初始”色谱图。通常使用带有紫外检测功能的 C18 色谱柱进行反相分离。在这一阶段，需要决定是：开发梯度方法还是等度方法，这两种方法都具有不同的优势，具体取决于分离要求和分析物的性质。
选择色谱柱
色谱柱是色谱仪的核心，在实现可靠、准确的分析中起着举足轻重的作用。选择好的色谱柱可确保良好的色谱分离效果，从而获得值得信赖的结果。反之，色谱柱选择不当会导致分离不充分和混乱，使结果无效或难以解释。
在方法开发过程中，改变色谱柱会极大地影响待测物的分离度。粒度、保留能力、固定相化学成分和色谱柱尺寸等因素对于选择适合特定分析应用的理想色谱柱至关重要。色谱柱的三个基本组成部分是：硬件、填料和固定相。氧化铝、锆、聚合物以及最常见的硅胶等填料作为固定相的载体。硅胶因其强度高、球形大小一致、易于衍生和耐压而受到青睐。在选择理想的色谱柱时，需要考虑的因素包括颗粒大小、保留能力、固定相化学成分和色谱柱尺寸。这些因素共同影响着色谱柱在特定分析应用中实现准确可靠分离的效率和效果。
硅胶在大多数有机溶剂和低 pH 值环境中化学性质稳定。然而，其缺点是传统的硅胶在 pH 值超过 7 时会分解。所以说色谱柱选择时也需要主要PH适用范围（注：色谱柱说明书上有ph适用范围），否则选择不合适的色谱柱进行使用会导致色谱柱寿命大打折扣。硅胶的成分、形状和粒度均会对分离产生影响。一般来说，粒度越大，理论塔板数越多。正相或反相色谱柱的适用性取决于所采用的固定相类型，这凸显了硅胶色谱柱在各种色谱应用中的多功能性。
正相色谱涉及使用极性固定相和非极性流动相，极性分子的洗脱时间通常晚于非极性分子。在反相色谱中，色谱柱的选择至关重要。例如，丙基色谱柱（C3）、丁基色谱柱（C4）和戊基色谱柱（C5）对具有疏水残基的大分子和肽类物质非常有利，尤其是在离子对色谱法（C4）中。不过，与 C8 或 C18 固定相相比，C3-C5 色谱柱保留非极性分析物的效果通常较差。这些色谱柱化学成分的变化使得在色谱分析中可以对不同化合物进行定制化分离。
YMC-Pack C4、Luna C5 和 Zorbax SBC3 等反相色谱柱代表了反相色谱柱的特点。不过，与烷基链较长的色谱柱相比，烷基链较短的色谱柱（如 C4 和 C5）可能具有较低的抗水解性。辛基（C8）相在各种应用中都很有用，对类固醇、核苷和药物等化合物具有优势，但其保留性不如 C18 相。固定相或色谱柱的选择在方法开发中至关重要，因为如果没有可靠、高性能的色谱柱，就很难建立可重现的程序。稳定性和可重现性对于避免在方法开发过程中出现样品保留问题至关重要。影响这种差异的关键因素包括键合固定相的参数、硅胶填料的特性以及色谱柱的直径。硅胶填料因其有利的物理特性而成为现代色谱柱的首选，在实现分析应用的多样化和精确分离方面具有多功能性和高效性。
色谱柱选择时也需要主要PH适用范围（注：色谱柱说明书上有ph适用范围），否则选择不合适的色谱柱进行使用会导致色谱柱寿命大打折扣。
分离模式选择
分离模式由分析物的极性和分子量决定。在实际应用中，反相色谱法（RPC）尤其适用于小型有机化合物。反相色谱广泛用于分离酸碱等可电离物质，采用离子对试剂或含缓冲盐流动相来防止分析物发生电离。
等度/梯度模式选择
探索梯度是指：在设定的时间内（标准为 20 分钟），从约 5-10的 %B（B;一般为有机相） 到 100 %B 的线性梯度。洗脱强度在 100% B 时保持几分钟，以确保所有样品组分都已洗脱。对于反相梯度洗脱，通常选择水（或缓冲液，如果有可电离的分析物）和乙腈作为流动相。使用易挥发的缓冲液（如甲酸铵）可使方法与用于 LC-MS 的质谱兼容。从色谱图中可以看出很多有关流动相组成、色谱柱化学成分和分离所需的分析模式的信息。如果化合物在梯度结束后的洗脱时间超过梯度时间的 25%，则需要使用更强的 B 溶剂或保留性更差的色谱柱进行分析。此外，公式 1（其中 tG 为检测梯度时间，△t为第一个峰至最后一个峰所需要的时间），△t/ tG ＜0.25一般选择等度分析，反之选择梯度模式更为合适，可用于确定是否可以进行等度分离；这始终是首选，因为它可提高样品的分析通量（无需重新平衡时间）并简化分析。在建立梯度时，应将洗脱出第一个峰的流动相成分作为初始流动相成分或者也可做为稀释剂。
流动相的选择以及优化
尽量选择毒性小的溶剂，我们应该了解常用试剂的MSDS，尤其了解其毒性以及如何处理突发情况。
2.然后我们选的溶剂之间是相互互溶的。
3.与检测器匹配：紫外：流动相的截止波长要低于样品的检测波长；RI：流动相的折光系数与样品的差异较大；ELSD：挥发性或受热分解成气体的流动相；质谱：能促进相应离子源模式下化合物的电离。
4.粘度低：高粘度溶剂会影响传质和扩散，降低柱效，柱压会高。
5.流动相pH：反相模式下，对于可电离的化合物，应调节流动相pH使待测物不电离，处于分子状态。一般酸性分析物使用流动相pH比分析物酸度系数更低的流动相，碱性分析物使用流动相pH比分析物酸度系数更高的流动相。
6.流动相中的缓冲盐：应考虑缓冲盐在有机相中的溶解度，一般运行梯度不会超过70%有机相，防止泵头处盐析，应考虑将B相配制成有机相与水混合溶液。
7.离子对试剂能不用尽量不用，如果用的话，尽量专柱专用，因为离子对会使色谱柱填料改性。
8.流动相的纯度，HPLC用色谱纯有机相，水用二次纯水或屈臣氏蒸馏水，质谱需用质谱纯的有机相和水。
9.不能对色谱系统造成损坏，比如二氯甲烷会腐蚀泵的金属组件，可与其他试剂预混后使用，用完要及时置换系统；碱性流动相会对普通色谱柱的硅胶溶解塌陷，有机杂化的硅胶对碱性环境的稳定性更好一些。
10.不对样品造成破坏。
另外对于制备色谱的流动性有两点补充：
1.对样品有一定的溶解性，如果对样品的溶解性差，会导致样品析出，会影响分离，甚至堵塞进样器或色谱柱。
2.挥发性好、沸点低，利于分离后的馏分后处理。
❖ pH 值的影响
对于可电离的分析物，根据分析物的 pKa 值确定合适的流动相 pH 值至关重要。这可确保目标分析物处于中性或离子化状态。调节流动相 pH 值是优化分离的重要方法。pH 值调节在调整色谱条件以实现理想的分离效果方面起着至关重要的作用。
❖ 有机相的影响
为反相 HPLC 选择有机相通常很简单，最常用的是乙腈和甲醇（偶尔也用 四氢呋喃）。在溶剂强度保持不变的等度条件下，要使复杂的多组分样品中的每种成分都得到最佳的洗脱效果，可能具有挑战性。因此，通常采用梯度洗脱，允许在 k（保留因子）1 到 10 之间改变有机相成分。这种动态方法可提高分离效率，尤其适用于 HPLC 中的复杂混合物。
检测器和波长的选择
色谱分离后，使用适当的检测器对目标分析物进行鉴定。液相色谱（LC）中常见的检测器包括：紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器、示差检测器和质谱检测器。
检测器的选择受样品性质和分析目标的影响。例如，在多组分分析中，吸收光谱可能会比母体化学物质的吸收光谱波长更长或更短，这就影响了选择合适的检测器来进行准确和有选择性的鉴定。
在 LC 分析中，检测器的选择对达到所需的灵敏度和特异性起着至关重要的作用。在紫外检测中，目标分析物和杂质的光谱必须在不同波长下采集、叠加，然后进行归一化处理。选择波长对于确保大多数分析物都有足够的响应，从而在液相色谱中进行准确可靠的检测至关重要。仔细考虑不同波长的紫外光谱可确保分析方法对样品中的所有相关成分都很敏感，从而提高分析的精确度和可靠性。
创建分析方法
反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析方法开发的初始阶段包括选择各种色谱参数，如流动相、色谱柱、流动相流速和流动相 pH 值。通过试验，对每个参数进行优化，然后与系统适用性参数进行比较。典型的参数包括：保留时间超过 5 分钟、理论板数超过 2000 板、拖尾因子小于 2、分辨率大于 5 以及标准色谱中分析峰面积的相对标准偏差 (R.S.D.) 不超过 2%。这些参数确保了 RP-HPLC 方法的可靠性和精确性。
样品制备
样品制备是高效液相色谱（HPLC）分析的关键步骤，可确保获得均匀且可重复的溶液注入色谱柱。样品制备的目的是：制备出与色谱柱兼容且与所需 HPLC 方法相匹配的无干扰等分样品。这就需要选择能溶解在流动相中而不影响保留或分辨率的样品溶剂。样品制备的初始步骤包括：收集样品并将其注入色谱柱，为准确可靠的色谱分析奠定基础。识别方法中的弱点，并采用实验设计来增强它。评估该方法对各种样品、设备配置和环境因素的影响。这一迭代过程有助于完善方法，确保 HPLC 分析在不同条件下的稳定性、可靠性和适用性。
供试品溶液的浓度：分析方法的定量限应当≤报告限度。
稀释剂：对于检测方法无干扰，溶解性好、溶液稳定、无溶剂效应、经济环保。
提取方式：超声（功率，频率，水温），震摇-耐用性、溶液稳定性。
稀释剂体积：小规格制剂关注辅料所占比例。
溶液的处理：滤过（引入杂质，滤膜吸附），离心。
辅料：积分时空白辅料应当予以扣除，根据耐用性验证中空白辅料出峰时间拟定范围，必要时标准中应当增订空白辅料溶液进样，辅料与API的反应。
验证
验证是评估和提供客观证据的系统过程，证明满足特定预期用途的具体要求。它包括评估方法的性能并证明其满足特定标准的能力。基本上，验证可以让您彻底了解您的技术可以可靠地产生什么结果，尤其是在处理痕量或 HPLC 等分析方法中存在挑战性条件时。
初步验证应当进行：强制讲解（分离度、物料平衡、峰纯度）、耐用性、定量限、溶液稳定性（杂质储备液、供试品溶液；对照品溶液）、准确度。
方法验证
验证是实验室测试的过程，以证明分析方法的性能特征符合预期分析应用的要求。无论是由多个操作人员在相同或不同的实验室中使用相同的设备，任何新的或更新的方法都必须经过验证，以确保其始终产生可重复且可靠的结果。特定的方法及其预期用途决定了所需验证程序的类型，从而确保分析过程稳健并适合各种环境下的目的。
方法验证结果是任何可靠分析程序的重要方面，提供对分析结果质量、一致性和可靠性的评估。验证过程的关键是使用符合规格、经过正确校准、运行正常且功能正常的设备。验证过程确保对分析方法进行彻底评估，如果不符合要求的标准，则验证方法可以使用或失效。这确保了各种应用中分析结果的准确性和可靠性。
以下是FDA、USP和ICH推荐的典型参数：
1.专属性
2.线性与范围
3.精密度，包括方法精密度（重复性）和批内批间精密度（重现性）
4.准确度（回收率）
5.溶液稳定性
6.检测限
7.定量限
8.可报告区间
9.系统适应性
