高效液相色谱 (HPLC) ：原理、类型、组成和应用

原理

高效液相色谱仪（HPLC）是一种以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有颗粒极细的高效固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测的仪器。其原理为色谱法的分离原理，即溶于流动相的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。高效液相色谱法（HPLC）是将少量液体样品注入装有微小颗粒（直径为 3 ~5 um，称为固定相）的柱子中，样品中的单个成分随着通过泵输送的高压液体（流动相）通过色谱柱进入装有颗粒的柱子。柱填料用于将成分相互分离。这涉及到其分子与填料颗粒之间的各种化学和/或物理相互作用。分离出来的成分会在色谱柱出口处被检测器检测到，检测器会测量这些成分的含量。检测器的输出称为 "液相色谱图"。

与低压柱液相色谱法相比的优势

与传统的低压柱液相色谱法相比，高效液相色谱法（HPLC）有许多优势。

· 灵敏度更高（可使用各种检测器）

· 更高的分辨率

· 速度更快

· 便于样品回收（移除的流动相更少）

· 多种固定相可适用

图 2.描述色谱法的分支。

类型

HPLC 的以下变体取决于工艺中的相系统（固定相）。

(1)正相高效液相色谱法

又称正相色谱法或吸收色谱法。这种方法根据极性分离分析物。它有一个极性固定相和非极性流动相。因此，固定相通常为二氧化硅，典型的流动相为正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。该技术适用于对水敏感的化合物、几何异构体、顺反异构体、类别分离和手性化合物。

(2)反相高效液相色谱法

固定相为非极性（疏水性），流动相为水性、中等极性。它的工作原理是疏水相互作用，因此材料的非极性越强，保留时间就越长。这种技术适用于非极性、极性、可电离和离子分子。

(3)体积排阻高效液相色谱法

又称凝胶渗透色谱法或凝胶过滤色谱法。色谱柱中填充有精确控制孔径的材料，颗粒根据分子大小被分离。较大的分子迅速通过色谱柱；较小的分子则穿过多孔填料颗粒，随后洗脱出来。体积法还有助于确定蛋白质和氨基酸的三级和四级结构。它还可用于测定多糖的分子量。

(4)离子交换高效液相色谱

在这种色谱法中，保留是基于溶质离子与固定相上的带电位点之间的吸引力。带相同电荷的离子会被排除在外。这种技术可用于纯化水、蛋白质的配体和离子交换色谱、碳水化合物和低聚糖的高 pH 阴离子交换色谱等。

(5)生物亲和高效液相色谱

在这类色谱中，分离是基于蛋白质与配体的可逆相互作用。